ncbi引物设计方法（如何从ncbi上看引物设计的好不好）
在今天的分享中，网站小编将与大家讨论关于ncbi引物设计方法的知识，并且我也会解释一些与之相关的如何从ncbi上看引物设计的好不好。如果我们能恰好解答你目前所面临的问题，记得要关注我们的网站。那么，就开始吧！
摘要预览：
如何用ncbi设计引物以及验证引物
引物5’端可以修饰。引物5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。验证引物的特异性：在“Primer Pair Specificity Checking Parameters”区，选择设计引物或验证引物时的目标数据库和物种。
打开NCBI上-BLAST-primer-blast网站，将上面复制的mRNA编号输入序列框中，下拉选项中选择你的物种，然后在Exon junction span下拉框选择Primer must span an exon-exon junction，设置引物长度最小和最大值，然后点击Get primer。
跟其它的BLAST一样，点击底部的“Advancedparameters”有的参数设置。模板（Template）在“PCRTemplate”下面的文本框，输入目标模板的序列，FASTA格式或直接用AccessionNumber。如果你在这里输入了序列，是用于引物的设计。
但是，并不是说预测出了非特异结果，引物的性质就一定不好，需要具体情况具体对待。Primer-Blast验证引物结果的意义是：可以准确判断一对引物是否能够将该基因的所有转录变体覆盖到。
怎么设计引物
1、引物3’端的碱基一般不用A。引物3’端的碱基一般不用Ancbi引物设计方法，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。
2、特异性：引物最好在模板cDNA的保守区内设计。引物应与核酸序列数据库的其ncbi引物设计方法他序列无明显同源性，不应有连续8个碱基与待扩增区外序列完全互补。可对其进行BLAST检测进行验证。
3、引物设计原则：长度： 18~30 bp， 20 bp左右最为常用。引物过短易导致非特异性打增ncbi引物设计方法；较长引物特异性强，但退火效率低，且易形成二级结构，从而导致PCR产量少。
4、以下是引物设计的一般步骤： 确定扩增区域：首先需要明确要扩增哪个DNA区域，例如基因的外显子、内含子或启动子等。 收集序列信息：从数据库中获取该区域的序列信息，如NCBI等公共数据库。
5、引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。
6、引物设计原则 长度：15—30bp，其有效长度[Ln=2(G十C)十(A十T)]一般不大于38，否则PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最佳作用温度(74度)，从而降低产物的特异性。
如何进行引物设计?
1、引物5’端可以修饰。引物5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。验证引物的特异性：在“Primer Pair Specificity Checking Parameters”区，选择设计引物或验证引物时的目标数据库和物种。
2、特异性：引物最好在模板cDNA的保守区内设计。引物应与核酸序列数据库的其他序列无明显同源性，不应有连续8个碱基与待扩增区外序列完全互补。可对其进行BLAST检测进行验证。
3、引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。
4、避免二聚体和自身互补：设计引物时需要避免两个引物之间形成二聚体或自身互补，这会影响PCR效率和特异性。 进行特异性检测：使用软件工具进行特异性检测，以确保所选引物只扩增目标DNA序列而不扩增其他非特异性DNA。
生信-使用NCBI进行目的基因的引物设计
在NCBI主页上方search栏左边有一个database选择框，点击下拉三角形选择nucleotide（如图红框）在search栏输入基因名搜索即可。
然后进入NCBI数据库里面选择自己需要设计引物的基因，然后查找到该基因的DNA序列。一般以搜索Nucleotide可以得到包含该基因序列的详细信息，图中以基因LOC100159271为例。
因为设计引物时是用目的基因设计的，PCR出来的是两条引物之间的序列。
网址引物设计和验证的推荐网站为：Primer-Blast。这是一个专门设计用于在已知序列上设计引物或探针的工具。
引物设计方法
1、引物所对应的模板序列的Tm值最好在72℃左右。Tm值在72℃左右可使复性条件最佳，至少要在55-80℃之间。
2、引物最好在模板cDNA的保守区内设计。引物长度一般在15-30碱基之间。引物GC含量在40%-60%之间，Tm值最好接近72℃。引物3′端要避开密码子的第3位。引物3′端不能选择A，最好选择T。
3、引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。
如何利用已知基因设计特异性引物?
最重要的是引物设计，首先要弄清楚你要扩增基因的大小，如果特别的长，那就需要做拼接PCR，再有就是要设计特异性好的引物以防止非特异的出现，对于这一点可以去NCBI做PRIMER BLAST。
去NCBI找到这个基因的序列，然后找到你需要的那个区段，在它上下游不改变阅读框的地方设计引物，正向引物在正义链，反向引物在互补序列里设计。20~25bp为宜。
进行引物设计可以引物长度、扩增跨度、引物成分等方面进行。提高扩增效率和特异性，尽可能抑制非特异性扩增。长度：15~30bp均可，常用20±3nt左右，但不应大于38；两个引物长度差异3nt。
要么直接用这个已知序列设计引物，多设计几对，碰巧哪对在保守区能P出来，就OK了。克隆测序，再做RACE。引物里可以加简并碱基，提高成功率，但是以特异性下降为代价，并且增加产物分析难度。
加上酶切位点，保护碱基。只要引物3’端不被封闭3个碱基，引物就可以用。PCR时也不用算退火温度，60度就可以，特异性和产量都没问题。你可以提高一下退火温度再试试。
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